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| 目的 | 分析glucose及lactate在medium中的含量，藉此分析細胞在medium中生長的情形為何。 |
| 原理 | 利用Glucose and Lactate Combined Enzyme-Color Reagent和glucose及lactate反應，在經由標準曲線推算sample中的量為何，可以瞭解細胞生長的代謝狀況為何。 |
| 材料 | Culture cell medium sample Combined Enzyme-Color Reagent |
| 設備 | 微量吸管 桌上離心機 分光光度計(UV-Vis detector) 4℃冰箱 震盪混合器 Hood CO2 incubator |
| 藥品 | MEM medium(or M199 medium) PBS (phosphate-buffer-saline) Glucose and Lactate Combined Enzyme-Color Reagent |
| 步驟 | 1.收集培養細胞的medium sample 2.將定量之glucose及lactate溶製成control(100mg/ml，40mg/ml)溶液 3.將control溶液及sample稀釋20倍，並加入一空白的試樣作為比較 4.分別加入Combined Enzyme-Color Reagent至control溶液和sample中，反應30min 5.反應時避免光照，降低實驗誤差 6.反應完後以分光光度計，glucose以波長450 nm，lactate以波長540 nm檢測 7.以control溶液做基準，並推算sample中glucose及lactate的含量 |
| 時間 | 約1.5hr |
| 備註 | Sample Glucose (mg/L) = sample / standard* 100 Sample lactate (mg/L) = sample / control * 40 |
| 目的 | 利用藥品處理，分離並純化大腸桿菌中之質體DNA |
| 原理 | 先將細胞懸浮於等張溶液中，再以含有SDS的鹼性溶液(pH12.0-12.5)處理細胞，使染色體DNA變性，在加入酸性溶液(pH5.5)中和後，變性的染色體DNA會形成團狀，而質體因為supercoil結構，故維持原狀，經離心後成團的染色體DNA及蛋白質會沉澱於管壁上，而質體會留在上清液中，再利用phenol進一步除去殘留的蛋白質，最後以酒精將質體沉澱下來即得。 |
| 材料 | 含有質體的大腸桿菌E.coli TOP10F' |
| 設備 | 微量吸管 1.5 ml小離心管 微量離心機 振盪混合器 37℃恆溫振盪培養箱 乾泳槽 -20℃冰櫃 真空抽氣機 |
| 藥品 | LB培養液 含有抗生素的LB培養液 phenol chloroform RNase A TE緩衝液(10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，pH8.0) Solution I：50 mM glucose，25 mM Tris-HCl (pH8.0)，10 mM EDTA (pH8.0)，經高溫高壓滅菌後保存於4℃ Solution II：1% SDS，0.2 N NaOH (現配) Solution III：60 ml 5 M pH5.5 KOAc ，11.5 ml glacial acetic acid，28.5 ml H2O |
| 步驟 | 1.將含有質體的大腸桿菌養在3 ml含有抗生素的LB培養液中，在37℃振盪培養箱中培養過夜 2.取1.5 ml的菌液到微量離心管中，在室溫中以14000 rpm離心1分鐘，並將上清液倒掉，留下細菌沉澱物 3.加入100 ml的Solution I，並以振盪器強烈振盪，使細菌懸浮於溶液中 4.加入200 ml新配製的Solution II，反覆倒轉微量離心管，使之混合均勻(不可使用振盪混合器) 5.加入150 ml的Solution III，反覆倒轉微量離心管，使之混合均勻 6.以14000 rpm離心10分鐘，將上清液移到新的微量離心管中 7.加入等體積(400 ml)1:1的phenol (pH>7.8):chloroform溶液，振盪使之混合均勻，再以14000 rpm離心5分鐘，將上清液移到新的微量離心管中 8.加入1 ml 95%的酒精，振盪混合均勻後放置於-20℃冰櫃20分鐘 9.以4℃ 14000rpm離心15分鐘，將上清液倒掉，留下DNA沉澱物，再用真空抽氣機將管壁上的酒精抽乾 10.將沉澱物溶在含有RNase A 的TE溶液中，於37℃乾泳槽中30分鐘 11.將DNA保存於-20℃ |
| 時間 | 約2~3小時 |
| 備註 | 1~2毫升的菌液約可得100 ng ~5 mg的質體DNA (其量會依據質體在宿主細胞中的複製倍數而有所不同) |
| 目的 | 以agarose膠體電泳法將DNA片段依大小予以分離 |
| 原理 | DNA含有磷酸根，在中性及鹼性環境下帶負電，通電後會往正極移動。洋菜膠體內有許多孔隙，濃度越高，孔隙越小。在電場中，不同大小的DNA片段，在洋菜膠體的孔隙內往正極移動，DNA體積月大者，移動時所受的阻力越大，使其移動較慢；而體積較小者，則移動較快。因此藉由agarose膠體電泳的過程可將不同大小的DNA分開 |
| 材料 | 質體DNA |
| 設備 | 電泳槽 UV-light box 電泳照相設備 |
| 藥品 | TAE緩衝液 Polaroid 667底片 1%洋菜膠 (加入0.35公克洋菜膠置盛有35毫升的1x TAE之燒杯中，加熱煮沸使洋菜膠溶解。待溶液冷卻至空手可以容忍的溫度後稱重，減輕的重量加ddH2O補足之。) 6x Loading Dye [0.25% Bromophenol Blue， 0.25% Xylene Cyanol FF，40% (w/v)、甘油，溶解於ddH2O中] Ethidium Bromide 稀釋10毫克／毫升的濃溶液成為200毫升5微克／毫升溶液（戴手套） 已定量的DNA marker |
| 步驟 | 1.置備35毫升的1%洋菜膠，降溫後倒入膠片盤中並插入17齒(tooth/well)的塑膠片(comb)於頂端，冷卻約30分鐘凝固後方可使用 2.加入2μl的6×Loading Dye至樣品，混合振盪後於室溫、6,000 rpm離心10秒鐘 3.將膠片盤放入核酸電泳槽中，倒入約300毫升的1×TAE以蓋過膠片表面 4.用微量吸管吸取5μl的marker加入靠兩端的孔中 5.吸取12 μl的DNA樣品並依序加入膠片的孔中 6.蓋好電泳槽，通以100伏特電力約30分鐘，注意藍色染料自〝負極〞向〝正極〞移動至離膠片底部約1.5公分處即可停止通電 7.將膠片於室溫下以5ug／ml Ethidium Bromide溶液染色5分鐘8.以紫外光照射膠片觀察紅色的DNA片段分布圖，並照相存檔 |
| 時間 | 約1小時 |
| 備註 |
| 目的 | 得知一段DNA鹼基的順序 |
| 原理 | 利用核?酸的類似物(analog)，因其沒有3'-hydroxyl group而可特定地終止DNA鍊的複製，並在類似物上標定不同的螢光，用電泳將長短不一的片段分開，利用雷色光偵測不同的螢光，即可在電腦中讀出DNA的順序 |
| 材料 | Template DNA primer terminator ready reaction mix |
| 設備 | Sequencing machine PCR machine |
| 藥品 | Buffer (80 mM Tris, pH 9.0、2 mM MgCl2)通0.22 μm filter |
| 步驟 | 1.準備template DNA，濃度以50 μg/ml左右最佳 2.在0.2 ml微量離心管中加入下列物品： terminator ready reaction mix 2 μl template DNA 1 μl primer (10 mM) 0.5 μl buffer 3 μl 無菌水 13.5 μl total 20 μ l3. run PCR program a. 95℃ 2.5 min b. 95℃ 30 sec c. 50℃ 30 sec d. 60℃ 4 min ( repeat b-d 25cycles) 4.純化： 加入2 μl 3 M sodium acetate pH 4.6及 95% ethanol 50 μl -> 室溫放置15分鐘 (若有通column則可在-20℃沈澱) -> 離心14000 rpm，15 min -> 70% ethanol 200 μl vortex -> 離心14000 rpm，15 min -> air dry 5. run sequencing machine |
| 時間 | Sample準備半天，加上機一天 |
| 備註 | 有廠商在賣純化的column，可得到更好的回收 |
| 目的 | 利用酵素連接去氧核?酸載體及插入物片段 |
| 原理 | 去氧核甘酸連接脢(Ligase)可以將互補的去氧核甘酸終端黏合 |
| 材料 | 限制酵素處理過的Insert DNA及vector DNA |
| 設備 | 微量離心機 混合振盪器 水浴槽 |
| 藥品 | 連接脢(T4 DNA Ligase) 10x連接脢緩衝液 |
| 步驟 | 1.由限制圖譜確認insert DNA及vector DNA的兩端可互補 2.將下列試劑加入微量離心管中 insert DNA 6 μl vector DNA 2 μl T4 ligase 1 μl 10x緩衝液 1 μl total 10 μl 3.置於16℃水浴槽中作用至隔天 |
| 時間 | 16~18小時 |
| 備註 | 1.作用完的ligation溶液可在進行大腸桿菌之轉型，以得到大量的ligastion產物 2.在T4 ligase酵素的使用量上，為達相同的接合效率，blunt ends所需的量大於sticky ends 10~100倍 3.在做連接反應前，vector DNA可先用CIP（去磷酸脢）處理，可得到較正確的接合產物 |
| 目的 | 以限制酵素處理含有一段insert DNA的載體 |
| 原理 | 限制酵素可以在雙股DNA分子上的特定序列做切割。各種限制酵素的主要差異除辨識的DNA序列不同外，作用時所需梨子濃度、pH值及作用濃度亦有所不同 |
| 材料 | 質體DNA |
| 設備 | 微量離心機 微量吸管 混合振盪器 乾浴器 |
| 藥品 | 限制酵素 限制酵素緩衝液 無菌水 |
| 步驟 | 1.將保存於-20℃的質體DNA取出解凍，混合振盪後於室溫、6,000 rpm離心10秒鐘使溶液集中於微量離心管底部 2.分裝5μl的質體核DNA至新的離心管中，並加入濃度為的1單位／μl之核酸限制?1 μl、1 μl的10倍反應緩衝液(10x Reaction Buffer)、和3μl的無菌水，使最後體積為10 μl DNA 5 μl 限制酵素 1 μl 10x緩衝液 1 μl (為總體積的十分之一) 無菌水 3μl（將體積補至10μl） total 10 μl 3.若進行雙重切割，則在5 μl的樣品中加入各1 μl的1單位／μl濃度之兩種不同酵素、2 μl適合兩種酵素的10×反應緩衝液 DNA 5 μl 限制酵素1 1 μl 限制酵素2 1 μl 10x緩衝液 2 μl (為總體積的十分之一) 無菌水 11 μl（將體積補至20μl） total 20 μl 4.將溶液混合振盪均勻，於室溫、6,000 rpm離心10秒鐘使溶液集中於微量離心管底部後，置入乾浴器中於37 ℃作用1小時 |
| 時間 | 90分鐘 |
| 備註 | 1.作用完後的質體DNA可利用洋菜膠電泳分析來DNA片段大小 2.限制酵素作用的量不可超過總體積的十分之一，否則會有star activity |
聚合脢鏈反應（polymerase chain reaction, PCR）
| 目的 | 在短的時間內，將某一特定的DNA序列進行量的放大 |
| 原理 | 利用DNA聚合?(DNA polymerase)反覆地進行DNA的合成。首先雙股DNA於95℃被開鏈分解成單股DNA，隨後利用引子在適當的溫度下與目標DNA結合，再於72℃下利用DNA聚合酵素將混合液中的dNTP一一連接上去，便完成了第一次的複製，如此重複N次便可得到2N個DNA的PCR產物 |
| 材料 | 模板DNA 核酸引子對 dNTP |
| 設備 | PCR機器 迷你電泳槽及鑄膠器 |
| 藥品 | Taq DNA polymerase 10 X PCR buffer 1 X TAE agarose |
| 步驟 | 1.取一支0.2 ml 薄壁PCR管，各加入下列各項： 模板DNA (50 ng/ml) 0.5 ml forward引子 (10 mM) 0.5 ml reverse引子 (10 mM) 0.5 ml dNTP (2 mM) 5 ml Taq DNA polymerase 0.5 ml 10 X PCR buffer 5 ml dH2O 38 ml total 50 ml 2. 設定PCR反應條件 a.95℃ 5 min b. 95℃ 15 sec c. 50℃ 15 sec d. 72℃ 15 sec (repeat b-d 30cycles) e. 72℃ 5 min 3. 將PCR管子置入反應器中進行反應 4. 取10 ml PCR產物進行電泳分析 |
| 時間 | 約3小時 |
| 備註 | 1.解鏈、引子黏著及延長的時間可依據DNA長短而作調整。 2.應用： A.反轉錄聚合酵素連鎖反應(Reverse Transcription-PCR，簡稱 RT-PCR)，利用RNA來製備大量的DNA B.定點突變(site-directed mutagenesis)的技術，原則上可以將已知基因上任何位置的核?酸替換、刪除或加入，對於分析基因、蛋白質之結構與功能關係非常有用 |
| 目的 | 可在短時間內將大腸桿菌plasmid DNA抽取出來 |
| 原理 | 快速破壞細胞壁和細胞膜使DNA流出，然後萃取DNA |
| 材料 | 大腸桿菌 |
| 設備 | 恆溫振盪培養箱 混合振盪器 微量離心管 微量吸管 |
| 藥品 | LB培養液 TENS(10mM Tris-HCl、pH7.5、1mM EDTA、0.1N NaOH、0.5％ SDS) 95％酒精 70％酒精 |
| 步驟 | 1. 取1 ml的菌液離心，14000 rpm 2分鐘 2. 小心倒掉上清液，並預留些微上清液重新懸浮菌液 3. 加入300 ml之TENS溶液，震盪數秒 4. 加入150 ml之3 M，NaOAc (pH=5.3)溶液，震盪數秒 5. 離心14000 rpm 2分鐘，吸取上清液至乾淨的小離心管中6. 加入95％之酒精900 ml，混合均勻，離心14000 rpm 2分鐘 7. 倒掉上清液，加入1 ml之70﹪酒精，離心14000 rpm 2分鐘 8. 將酒精倒掉，使DNA風乾 9. 以20 ml的無菌水溶之 |
| 時間 | 20分鐘。 |
| 備註 | 此法雖然快速但抽出來的DNA純度並不高。 |
| 目的 | 將帶有目標基因的重組質體DNA轉型至大腸桿菌中，利用質體DNA會在大腸桿菌中複製的特性來獲取大量的目標基因 |
| 原理 | 短暫的高電壓可使大腸桿菌接受外來的DNA，藉此達到轉型的目的 |
| 材料 | 大腸桿菌 質體DNA |
| 設備 | 電衝機 電衝cuvette 乾浴機 恆溫培養箱 |
| 藥品 | SOC (0.5％ yeast extract、2％ tryptone、10 mM NaCl、2.5 mM KCl、10 mM MgCl2、10 mM MgSO4、20 mM glucose) 含有抗生素的LB培養液及培養基 冰無菌水 甘油 |
| 步驟 |
A.勝任細胞的準備（全程冰上操作） 1.將大腸桿菌單一菌落培養在含有抗生素的LB培養液37℃隔夜 B.大腸桿菌之轉型 1.取適量質體DNA與1管勝任細胞混合均勻（比例不要超過1/10，否則會降低效率） |
| 時間 | 培養時間不算，約3小時 |
| 備註 | 1.此法所製備之勝任細胞效率約為109 colonies/ug 2.勝任細胞不宜存放過久，會減低其轉型效力 |
| 目的 | 將帶有目標基因的重組質體DNA轉型至大腸桿菌中，利用質體DNA會在大腸桿菌中複製的特性來獲取大量的目標基因 |
| 原理 | 鈣離子會使大腸桿菌細胞膜較為疏鬆，在經過短暫熱休克的處理可使大腸桿菌接受外來的DNA，藉此達到轉型的目的 |
| 材料 | 大腸桿菌 質體DNA |
| 設備 | 乾浴機 恆溫培養箱 |
| 藥品 | LB 含有抗生素的LB培養液及培養基 0.1 M CaCl2 0.1 M CaCl2+15%甘油 |
| 步驟 |
A.勝任細胞的準備（全程冰上操作） 1.將大腸桿菌單一菌落培養在含有抗生素的LB培養液37℃隔夜 B.大腸桿菌之轉型 1.取適量質體DNA與1管勝任細胞混合均勻 |
| 時間 | 培養時間不算，約3小時 |
| 備註 | 1.此法所製備之勝任細胞效率約為5×106~2×107 colonies/ug 2.勝任細胞不宜存放過久，會減低其轉型效力 |
| 目的 | 可在短時間內將酵母菌的genomic DNA抽取出來 |
| 原理 | 利用藥品快速破壞酵母菌細胞壁和細胞膜使DNA流出, 然後萃取出genomic DNA |
| 材料 | 酵母菌 |
| 設備 | 恆溫振盪培養箱 混合振盪器 微量離心機 微量吸管 |
| 藥品 | YPD 培養液 Triton X-100 SDS NaCl Tris-Cl (pH 8) Na2EDTA phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1) acid-washed glass beads |
| 步驟 | 1. 將小量的酵母菌置於YPD中(最少1.5 ml)，在30 ℃ 震盪培養箱中培養12-16小時 2. 取1.5 ml 培養液置入微小離心管，並藉由離心機離心最大轉速5秒鐘並收集細胞 3. 去除上清液，並留下一些培養液，然後充分地震盪混合 4. 加入0.2 ml 的2 % Triton X-100，1 % SDS，100 mM NaCl，10 mM Tris-Cl (pH 8)，1 mM Na2EDTA，0.2 ml phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1)，再加入0.3g acid-washed glass beads 5. 震盪2分鐘，加入0.2 ml 的TE (pH 8) 6. 離心5分鐘，取出水層的溶液至另一個微小離心管，並加入100%酒精,混合均勻 7. 離心兩分鐘，去除上清液，自然乾燥後，加入0.2 ml TE溶解離心物，再加入0.3 mg/ml RNase A，置於37 ℃ 5 min，加入10 ml 4M ammonium acetate 和1 ml 100%酒精,混合均勻 8. 離心兩分鐘，去除上清液，自然乾燥後，溶於 50 ml TE |
| 時間 | 培養時間不算, 大約30分鐘(依管數不同而有而增加) |
| 備註 | 1.5 ml 酵母菌細胞約有2-4 mg的 DNA |
| 目的 | 利用鹼性陰離子加上熱休克快速地處理完整的細胞，以利將質體DNA引入酵母菌中 |
| 原理 | 在重組DNA技術中，酵母菌（yeast）乃是一種很重要的寄主生物，可用質體DNA為媒介物引入外來DNA並表現之。其轉型技術與大腸桿菌相似，利用鹼性陰離子加上熱休克快速地處理完整的細胞，可使酵母菌的細胞外鞘發生變化，有利於吸收質體DNA。 |
| 材料 | 酵母菌〈?MNN10〉 質體DNA |
| 設備 | 30 ℃培養箱 離心機 酒精燈 接種環 乾浴機 |
| 藥品 | One step buffer (Lithium acetate 0.2N、PEG-3350 48%、SSDNA 50mg/100ml、DTT 100mM) YPD培養液 selective medium |
| 步驟 | 1.將酵母菌劃於YPD培養基中，置於30 ℃之培養箱中約3-5天 2.挖取一些菌洛加入100 ml 的One step buffer以懸浮酵母菌 3.加入50 ng~1 mg的質體DNA，混勻並熱休克45 ℃ 15分鐘 4.塗於selective medium中，置於30℃恆溫箱中3~5天 5.長出的菌落即含有質體DNA，可進一步養大量作蛋白質的表現 |
| 時間 | 6~8天 |
| 備註 | 酵母菌的轉型效率在每1 mg質體DNA中，約可獲取103-104轉形細胞，但不同的因子皆會影響轉形的效率，包括質體DNA吸收能力與質體的大小、DNA的構形、寄主品系等。 |
| 目的 | 以大腸桿菌在試管中表現選殖的基因，大量製造蛋白質 |
| 原理 | 加入IPTG刺激含有lac operon的細菌，可以調控選殖基因的蛋白質表現 |
| 材料 | 含有選質基因的大腸桿菌E.coli (DE3) BL21 |
| 設備 | 恆溫振盪培養箱 混合振盪器 微量離心機 微量吸管 分光光度計 塑膠比色管 |
| 藥品 | LB培養液 IPTG (100 mM) 適當的抗生素 |
| 步驟 | 1.將轉殖成功的單一大腸桿菌E.coli (DE3) BL21菌株以微量吸管尖接種到5毫升含有適當抗生素的LB培養液中，於37℃以250
rpm振盪培養12~16小時 2.將1毫升菌液轉移至10毫升的新鮮LB培養液(含適當抗生素)中，於37℃以250 rpm振盪培養3~4小時，直到OD600達到1.2 3.收集1.5毫升細菌樣品至微量離心管中，於室溫以6000 rpm離心1分鐘 4.倒去培養液並將離心管倒置以使沉澱物乾燥，並保存於-20℃冰櫃 5.加入0.1毫升100 mM IPTG溶液至剩餘的菌液，使最終濃度成為1 mM 6.加入IPTG後四小時、六小時及隔夜各取一次1.5毫升菌液，並離心沉澱以收集細胞 7.將所有細菌沉澱物冰凍保存於-20℃冰櫃 8.將所有細胞沈澱誤打破後可於SDS PAGE上看到表現量最大的時間點，則可以此條件作蛋白質大量表現 |
| 時間 | 約需2天 |
| 備註 | 每種蛋白質表現的量會依其蛋白質特性、載體特性、宿主特性、誘導時間及IPTG濃度不同而有所差別。 |
| 目的 | 利用金屬親和性管柱(metal affinity column)來大量純化帶有affinity tag的基因重組蛋白 |
| 原理 | 由於六個Histidine 所組成的His Tag (metal affinity tag)可與Ni2+ bind，所以利用基因重組技術在表現的蛋白質加上His Tag，再以金屬親和性管柱(Ni-NTA)及liquid chromatography來大量純化蛋白質。 |
| 材料 | Protein source (E.coli 打破細胞後的溶液) Ni-NTA affinity column |
| 設備 | 微量吸管 高速離心機 incubator 震盪混合器 liquid chromatography cold room sonicater |
| 藥品 | LB medium PBS (phosphate-buffer-saline) IPTG antibiotic(Amp) Binding buffer(5 mM imidazole，0.5M NaCl ，20mM Tris-HCl，PH=7.9) Wash buffer(60 mM imidazole，0.5M NaCl ，20mM Tris-HCl，PH=7.9) Elute buffer(1 M imidazole，0.5M NaCl ，20mM Tris-HCl，PH=7.9) |
| 步驟 | 1. 將induce 後的菌培養至適當時間後離心打破，以PBS溶取所需之protein 2. 先以5X管柱體積之Binding buffer清洗管柱，流速為1 ml/min，將管柱調整至適合binding的狀況。 3. 待管柱準備好之後，注入蛋白質溶液進行binding，流速降低至0.5 ml/min。 4. 接著以Wash buffer將多餘的蛋白質(non-binding protein)清洗掉，5X管柱體積，流速為1 ml/min。 5. 最後以Elute buffer(high imidazole conc.)將Target protein給elute出來。 |
| 時間 | 約4 hr |
| 備註 |
| 目的 | 可利用帶有鎳離子（Ni2+）的His-bind親和力管柱純化出His-tag重組蛋白 |
| 原理 | 因為含有His-tag的DNA序列（於目標基因之後含有6個histidine序列），因此在所表現目標蛋白質C-端帶有His-tag，此His-tag序列可與帶二價正電的陽離子相螯和，故可利用帶有鎳離子（Ni2+）的His-bind親和力管柱純化出His-tag重組蛋白。 |
| 材料 | 含有選質基因的大腸桿菌 |
| 設備 | 層析管柱（column 1 ’ 10 cm，可容納5 ml） 分光光度計 超音波震盪機 |
| 藥品 | Charge buffer： 50 mM NiSO4 Binding Buffer：5mM imidazole、0.5M NaCl、20 mM Tris-HCl pH 7.9 Wash Buffer：20 mM imidazole、0.5 M NaCl、20 mM Tris-HCl pH 7.9 Elute Buffer： 20~200 mM imidazole、0.5 M NaCl、20 mM Tris-HCl pH 7.9 Strip Buffer：100 mM EDTA、0.5 M NaCl、20 mM Tris-HCl pH 7.9 |
| 步驟 | 1. 利用大腸桿菌大量表現重組蛋白，以一定濃度IPTG來誘導其表現，之後在4℃以4000
rpm離心20分鐘後取得菌體，若不馬上使用則可暫時將菌體凍於-70℃保存 2. 將菌體打散懸浮於20毫升的binding buffer，並加入20毫克的Lysozyme（1mg/ml），於冰上反應30分鐘 3. 之後利用超音波震盪30秒打破細胞，然後在4℃以13000 rpm離心15分鐘，取其沉澱物（inclusion body）用含有6M尿素的binding buffer將其溶解，再進行重組蛋白質純化 4. 配置Ni2＋管柱:取His-bind resin mix 3毫升，可配製成1.5毫升His-bind樹脂管柱，待所含之液體（20% 酒精）流至將乾，取3倍體積的滅菌水通入管柱內，接著以5倍體積的charge buffer注入，再以3倍體積不含6M尿素的binding buffer通過，最後以3倍體積含6M尿素的binding buffer平衡管柱 5. 將溶解在含有6M尿素的binding buffer重組蛋白通入已製備好的resin，在室溫下輕輕搖晃一小時，再以含有6M尿素的binding buffer及wash buffer清洗數次後，測量流出溶液OD280的吸光值，檢視是否已將其他雜蛋白清洗乾淨，最後將resin裝回管柱 6. 利用不同濃度imidazole elution buffer把重組蛋白沖提出來，每1毫升收集一管，並測量OD280的吸光值，以SDS-PAGE鑑定純度 7. 最後resin須以strip buffer把最後與resin結合的蛋白及Ni2+全部沖提下來，再以滅菌水沖洗數次，最後以20%酒精沖洗保存在4℃ |
| 時間 | 一天 |
| 備註 |
| 目的 | 檢測在溶液中所含水溶性蛋白質的量為何 |
| 原理 | 利用蛋白質染劑將待測溶液及標準溶液中的可溶性蛋白質染色，再以分光光度計量測成吸光值，藉著標準溶液所得到的標準曲線來推算待測溶液的蛋白質含量。 |
| 材料 | Protein solution Protein Dye |
| 設備 | 微量吸管 桌上離心機 分光光度計(UV-Vis detector) 4℃冰箱 震盪混合器 |
| 藥品 | BSA(standard protein) ddH2O Protein dye reagent(Bio-Rad Protein Dye Reagent) |
| 步驟 | 1.將標準蛋白分別溶於二次水中，得到標準不同濃度的蛋白質溶液，分別為1000, 500, 250, 125, 62.5, 31,15 μg/ml 2.將待測的蛋白質溶液也稀釋成1X、10-1、10-2… 3.同時間在已經準備好的Dye reagent(1/4 dye +3/4 ddH2O) 2.5 ml中加入50 μl的protein solution 4.迅速的(因為dye隨時間改變)以波長595 nm之分光光度計檢測標準溶液及待測溶液 5.將標準溶液做一標準曲線，再由標準曲線推算待測溶液的蛋白質含量 |
| 時間 | 30 min |
| 備註 | 吸光值 0.492 Protein (μg/ml) 476.371 |
| 目的 | 找出與已知蛋白有交互作用的其他未知蛋白 |
| 原理 | 將已知蛋白（餌）前接上GAL4 DNA-binding domain（DNA-BD），並使未知蛋白接於GAL4 activating domain（AD），若兩蛋白有交互作用，則AD和DNA-BD會使位於GAL UAS後的報導基因表現出來，使菌可存活於具有選擇性的培養基上 |
| 材料 | Yeast AH109 DNA-BD/bait AD/library sperm DNA |
| 設備 | 30℃恆溫培養箱 水浴機 震盪混合器 |
| 藥品 | YPD TE buffer (1mM Tris, pH 8.0, 100 mM EDTA) 1×TE/LiAc PEG/LiAc (40% PEG, 1×LiAc) SD/-Trp/-Leu培養基 SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-a-gal培養基 |
| 步驟 | 1. 刮取AH109的菌落養於5 ml的YPD中，置於30℃恆溫培養箱中震盪培養16~18小時
2. 室溫離心4500 rpm，5分鐘 3. 倒掉上清液，加入新的YPD 50 ml，震盪使菌體懸浮於培養液後置於30℃震盪培養3小時，使OD600=0.5~0.6 4. 室溫離心4500 rpm，5分鐘 5. 倒掉上清液，加入25 ml的TE buffer或滅菌水，震盪以打散沈澱物 6. 室溫離心4500 rpm，5分鐘 7. 倒掉上清液，加入1.5 ml的1×TE/LiAc打散菌體，即為酵母菌勝任細胞 8. 在1.5 ml的微量離心管中加入0.1 μg DNA-BD/bait、0.1 μg AD/library、0.1 mg sperm DNA，並將之混勻 9. 加入0.1 ml的勝任細胞，並震盪使內含物混合完全 10. 再加入0.6 ml的PEG/LiAc，震盪使內含物混合完全 11. 置於30℃震盪培養30min 12. 加入70 μl DMSO，溫和地將之混勻 13. 熱休克42℃、15 min後，置於冰上1~2 min 14. 室溫離心將菌體離下，除去上清液，加入1 ml的YPD，30℃ recovery 1小時 15. 14000 rpm離心，除去上清液，以1 ml的TE buffer wash 16. 最後菌體以30 μl的TE buffer resuspend，塗於SD/-Trp/-Leu的培養基上，置於30℃恆溫培養箱3~4天17.選取SD/-Trp/-Leu培養基上的菌落塗於SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-a-gal培養基上，置於30℃恆溫培養箱3~4天，若有菌落長出表示兩蛋白有交互作用，若無則否 |
| 時間 | 不算培養時間約半天 |
| 備註 |
| 目的 | 藉由抗體的專一性來辨認目標蛋白質 |
| 原理 | 蛋白質經SDS-PAGE後，膠片浸入轉印緩衝液，蛋白質可被轉印到PVDF纖維膜上，再利用抗體進行免疫染色。 |
| 材料 | 蛋白質樣品 |
| 設備 | 電泳槽 混合振盪器 微量離心機 微量吸管 電泳轉印槽 |
| 藥品 | Fast green染劑：0.1﹪fast green， 10﹪acetic acid，26﹪ethanol TN緩衝液：0.02M Tris-HCl， 0.15M NaCl，pH 7.5 |
| 步驟 | 1. 蛋白質樣品以SDS-聚丙烯胺電泳展開，並轉印到PVDF纖維膜上 2. 轉印後之PVDF纖維膜以fast green染劑染色2分鐘，再以二次水漂洗退染 3. 褪色後之PVDF纖維膜浸泡在含有3﹪脫脂奶粉的TN緩衝液，在室溫下輕輕搖晃1小時 4. TN-milk 緩衝液後以TNT緩衝液（TN緩衝液1升含有0.5毫升的Tween-20）漂洗4次，每次20秒 5. PVDF纖維膜將浸泡於一次抗體溶液（含IgG or IgE抗體的血清，以3﹪TNT-milk溶液稀釋所需倍數）中， 在室溫下輕輕搖晃1小時或4℃下16小時 6. 再以TNT緩衝液漂洗6次，每次10分鐘 7. 再將PVDF纖維膜浸泡於二次抗體溶液（含HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG antibody以3﹪TNT-milk溶液稀釋所需倍數）中， 在室溫下輕輕搖晃1小時 8. 以TNT緩衝液漂洗5次，每次10分鐘，再以TN緩衝液漂洗10分鐘1次 9. 將PVDF纖維膜以Detection buffer潤淨後，浸泡在呈色液至色帶出現。倒出呈色液，加入二次水漂洗數次以終止反應 |
| 時間 | 兩天 |
| 備註 |
| 目的 | 利用細胞來分析病毒的特性及數量 |
| 原理 | 利用病毒感染及傷害細胞的特性，將逐被稀釋的病毒液與細胞共同培養，再經由染劑將存活的細胞染色而得到病毒殺死細胞所留下的病毒斑，即可推斷病毒的數量或是感染能力為何。 |
| 材料 | Mammalian cell virus |
| 設備 | 微量吸管 Hood CO2 incubator 4℃冰箱 磁石攪拌器 桌上離心機 |
| 藥品 | MEM medium (10% FBS) MEM methylcellulose Trypsin-EDTA Glutamine PBS (phosphate-buffer-saline) Antibiotic (P/S) stain solution(Napthol blue-black) |
| 步驟 | 1.將細胞養於T-flask中，當細胞生長至近乎九成滿後以2 ml PBS+1 ml Trypsin-EDTA加入將細胞懸浮 2.加入適量之MEM medium 混和細胞，再把細胞轉養至6-well plate中培養overnight (37℃，5% CO2) 3.將待測之病毒液連續稀釋後(1X、10-1、10-2…..)，逐次將病毒液加入各個well中，輕輕拍動plate使液體均勻分散後，在放回incubator 中培養1 hr 4.加入MEM methylcellulose 後，再培養約3~4天(依病毒之特性而定)。 5.待時間到達後，將plate中的MEM methylcellulose吸除，逐個加入1~1.5 ml的stain solution6.靜置約一天後，把stain solution倒掉，以清水緩和沖洗剩餘的dye。 7.可見存活的細胞為深藍色，而病毒感染過的死細胞呈現空白，即代表病毒斑 8.藉由稀釋的倍數及病毒斑的數目推算病毒的數量 |
| 時間 | 約5~6天 |
| 備註 |