LS1802基礎生命科學實驗 講義3-1

實驗三：微生物的觀察與培養
（一） 細菌的觀察與培養
（二） 細菌的分離與鑑定
（三） 細菌的染色與計數

實驗目的：
（一）訓練同學熟悉基本的微生物實驗設備的使用方法和操作技術；
（二）練習無菌操作與純系細菌培養的方法；
（三）細菌染色與鑑定之基本概念；

概說
本實驗主要是希望同學學習和熟悉生命科學實驗中最基本的微生物操作技術與方法，
了解滅菌、無菌操作、分離方法、純系培養、染色鑑定與計數的方法。這些技術將是
未來微生物學、分子生物學等等實驗的基礎。

微生物實驗(一)--細菌的觀察與培養
<目的>
把實驗用於日常生活中, 以不同來源的水質樣品作材料，檢測水中微生物的數目與
種類，並由培養結果中觀察各種細菌的菌落型態。由單一個細菌分裂，繁殖而形成
的細菌族群稱為菌落(colony)，不同種類的細菌所形成的菌落形態也各不相同，其
形態指標包括菌落的大小、顏色、氣味、表面光滑或粗糙、邊緣平整或呈鋸齒狀，
是否有黏液。因此同學們可以從中了解表面的巨觀判斷與顯微鏡下的觀察作一比較。

<方法>
1.樣品水洗以振盪混合器(vortex mixer)搖勻。
2.以pipetman(微量吸管)吸取0.1ml的水滴在培養基上。
3.浸在酒精中消毒的抹棒先滴掉大部分酒精，再以火焰燒去剩餘的酒精。
4.抹棒放涼後，把培養基上的水液塗抹均勻。
5.在培養皿底部標明組別及水的樣品來源。
6.培養皿的底部朝上，在32℃培養，隔日觀察。觀察項目包括培養皿上的菌落數與
菌落形態。
7.有興趣的同學取不同菌落的細菌作成抹片後，染色觀察。(方法如第一部分所述)

<注意事項>
1.微量吸管的旋轉鈕為調整體積之用, 因應實驗需要調到100μl(即0.1ml)處，可
由刻度窗上看到。其上方按鈕是取放液體時使用，在吸取液體時先在外面壓到第一
段之後在伸入液體中取樣，取樣時的動作不可以過大，以免液體上噴後污染微量吸
管。為將液體壓出，必須將按鈕壓到第二段，才能把吸入的液體完全排出，第一段
與第二段按鈕的感覺可在操作前先行熟悉(旁邊的按鈕則為丟棄吸頭之)。
2.使用完後抹棒直接放入酒精杯中，不要經過火焰，以免引起杯中酒精燃燒。
3.所有標註字體應寫於底部(有培養基的那部分)，以免因蓋錯蓋子而得錯誤結果。

<作業>
1.樣品水中的菌落總數(個/ml)，請註明培養時間及水的來源。
2.所作的塗抹培養中，有多少不同型態的菌落出現，請依其型態指標描述。
3.描繪各菌落中的細菌外形，及為G(+)或G(-)。(可依各人對本實驗的喜好決定是
否作此題)

<參考資料>
可感染人類的致病性微生物適存於環境中，包括土壤與水，甚至可以寄生或共生
方式存在於脊椎或無脊椎動物體內。區分微生物種類的方法包括形態、生化、與
血清測試等步驟，有些需三種都做才能區別，有些則是一種即可。而治療情況下，
對病原菌的辨認是刻不容緩的，為確保病人能快速接受治療，則要藉著分離與鑑定
感染菌才能取得。因此，我們列舉中以下幾項臨床實驗中常用的形態與生化測試方
法作為參考。

§ Staining
Gram  stain：鑑定細菌最重要的步驟，把細菌區分為革蘭氏陽性(G+)或革蘭氏陰
性(G-)兩種。可製作生物抹片於玻片上，進行染色步驟(方法如第部分所述)。過量
的染液(Gram's iodine)可用水沖洗去除，此處iodine作為媒染劑(mordant)並把
crystal violet固定於細菌的細胞壁上，在使用數滴alcohol-acetone solution退
除染色後，因為細胞壁的構造差異，G(+)可抵抗此脫色程序而呈紫色，G(-)則被退
染脫色。此時使用第二種染劑safranin(red)染色，G(+)固已被染色仍呈藍或紫色，
而G(-)則被染成紅色。

Acid-fast stain：與Gram stain類似，是一區分作用的染色，但使用限制較大，通
常用於區分Mycobacterium，如痳瘋leprosy與結核菌tuberculosis，因為他們都是
嗜酸菌。首先以carbol-fuchsin(red)染色後，再以酸和醇加於抹片上脫色；
Mycobacterium因細胞內的脂質含量是G(-)的三倍之多，而可抵抗酸和醇的脫色。接
著的第二度染色則以Methylene blue進行，此時嗜酸菌不會被染上，而呈紅色或粉
紅色，而其他非嗜酸菌則被第二次的染劑染成藍色。

§Biochemical tests:
鑑別細菌種類最常用的步驟，通常是以糖類代謝的生化性質與其他的特共同進行，
以鑑定細菌種類。

Fermentation test(醱酵測試)：傳統的醱酵測試是在特別的醱酵管中進行，
每一試管包含下列成分：
(1)	nutrient medium，營養基；以供給大部分的細菌生長。
(2)	單一種可醱酵的碳水化合物，如葡萄糖，乳糖或蔗糖。
(3)	pH indicator，酸鹼指示劑，如phenol red。
(4)	一倒置的小管稱為Durham tube，用於捕捉醱酵後產生的氣體。

假使微生物的生長只能使用營養基而不醱酵其他糖類，則培養基的pH為鹼性，而
使phenol試劑呈現紅色；假如此微生物也可同時代謝糖類，則代謝產物除了酸之
外，有些微生物也會有氣體產生。此時酸會與培養基上的pH指示劑作用，以phenol
 red為例，則會使培養基呈現黃色；所產生的氣體則會取代出倒置管中的液體而被
肉眼觀察到。

Hydrogen sulfide production ：胺基酸的cysteine及無機的硫代硫酸(thiosulfate)
中所含的硫可以被某些微生物還原成硫化氫的氣體，此氣體因為可與亞鐵鹽(ferrous 
salt)作用，產生硫化亞鐵(ferrous sulfite)的黑色沈澱而被偵測到。此反應為：

	FeSO4H2S → FeSH2SO4

Indole fermentation: indole是胺基酸的tryptophan，根據下列反應氧化生成的產物：

	CH2CH(NH2)COOHC8H7N → CH3COCOOHNH3
	tryptophan		indole	pyruvic acid   ammonia

含tryptophan的培養中加入kovac's reagent進行培養，即可測到所生成的indole，
它會與試管中的液體反應產生紅紫色的環。

Tripe-sugar iron agar (TSIA)：TSIA含三種碳水化合物葡萄糖、蔗糖與乳糖，其中
葡萄糖的濃度是其他種糖的1/10，此培養基中也含有其他的營養成分，以供大部分的
細菌生長，培養基中還添加可被還原產生硫化，氫的硫代硫酸(thiosulfate)，除此之
外，作為指示酸鹼之用的phenol red也存在其中，用於顯示試管中的agar斜面上，最
後刺入agar中，其目的在維持管中的厭氧環境，以供產生如H2S之類的醱酵反應進行。
以下反應可發生在TSIA管中：

1.如果葡萄糖是唯一被用於醱酵的糖類，則斜面呈現紅色(表示是鹼性)--由葡萄糖醱
酵產生的酸濃度很小，而且很快就與斜面上的氧氣進行氧	化，使試管表面的agar
呈黃色，此乃因為缺乏空氣的環境下，所產生的酸不能被完全氧化所致。
2.假如被代謝的糖類是蔗糖與乳糖，則斜面和底部會呈黃(酸性)，因為酸的濃度極高，
在培養所需的時間內不可能被完全氧化所致。
3.假如培養基中只有蛋白質被代謝掉，而無其他糖醱酵，則所釋出的鹼性產物(如氨氣)
會使斜面及其他殘餘部分呈紅色。
4.如果有硫化氫的產生，此氣體會與培養基內的鐵鹽反應，產生硫化亞鐵的黑色沈澱。
5.如果所產生的氣體是二氣化碳與氫氣，這些氣體會取代管柄部分的agar，而使此部分
的agar含氣泡。

Decarboxylases：有些微生物會對特定種類的胺基酸，進行脫酸作用，這些酸是由培養
液中所含的胺基酸所誘導生成。常用於測試脫酸存在的胺基酸為lysine，ornithine，
與arginine；脫酸反應所釋放出的中性產物可以用bromocresol purple作為指示劑直接
測知，此試劑在酸性環境下呈黃色，鹼性環境下呈紫色。

Hemolysis：有些細菌的特徵是造成紅血球細胞的溶血作用。導致溶血的因子稱為溶血
素(hemolysin)，可以是有機物(例如各種不同的毒素)或無機物(如H2O2，hydrogen 
peroxide)。欲偵測溶血現象，可以在培養基的洋菜中加入完整的紅血球細胞，再將等
診斷的樣品畫在上面，分離出單一菌藻。進一步的培養可發現分離出的菌落包括不溶血、
部分溶血(α-hemolysis)、與完全溶血(β-hemolysis)等三種。在部分溶血的菌落周圍，
因為有紅血球內的血紅素被部分改變而呈綠色，完全溶血的菌落周圍則會造成透明的環狀
區域。

微生物的觀察與培養(二)=Gram-Staining
<簡介>
1884年丹麥醫生Gram發明 Gram-Staining，至今仍為鑑別細菌之最重要方法。依據 
Gram-staining我們可將細菌分為兩類，一為Gram-positive，一為Gram-negative。
其染色原理至今未明，推測其與此二類細菌之細胞壁結構有重大關係。說法有二，其
一為：Gram-negative 細菌之細胞壁含脂量高，以酒精處理時會將部份脂質(lipid)萃
取出來，而使細胞壁結構鬆動，通透性(permeability )增加，故crystal violet-I複
合體被帶出細菌體外而無色。Gram-positive 細菌之細胞壁幾乎不含脂質，酒精甚至會
使細胞壁脫水，故結構更形緻密，Crystal violet-I複合體就被留在細菌體內。其二為：
酒精處理時，會使 peptidoglycan空隙縮小，Gram-positive 細菌之 peptidoglycan 
wall 較會而Gram-negative者較薄(如附圖)，所以Crystal violet-I複合體離開Gram-
negative細菌的機會較大。
在本實驗中，我們在酒精處理後，用紅色的Safranin O複染，此時無色的Gram-negative
細菌就會變成粉紅色，而本來己染上藍色的Gram-positive細菌就會變成紫色。

<材料及使用儀器>
1.生物材料：Escherichia coli及Deinococuus SP.

2.化學藥品：
(a)固定細胞用：5% Formalin(HCHO)in LB medium
(b)染色用：
(i)  Crystal violet staining
	A：Crystal violet 2.0g in 20ml 95%(v/v) Ethanol
	B：0.8g Ammonium oxalate in 80ml H2O
	A和B混合後靜置24小時濾掉固體雜質就配成 Crystal violet staining
(ii)  Mordant
	1g iodine和2g potassium iodine倒入研缽中研磨並在研磨過程中將
	300ml蒸餾水慢之加，入待所有粒子均溶在水中即可。
(iii)  Decolorizing Solvent
	95%(v/v) Ethanol
(iv)  Counter stain
	0.25g Safranin O in 9.75ml 95% Ethanol

3.使用儀器：
		離心機
		光學顯微鏡

<方法>
1. 收穫細胞。(用離心的方法)
2. 將細菌細胞重新懸浮於43.2ml不含yeast extract之LB培養液中，待細胞散置
均勻後再倒至另一已有6.8ml，37%HCHO之燒瓶中，充分搖晃燒瓶使HCHO作用完全
而均勻。3.5-15分鐘後，將HCHO固定液清洗乾淨，使細胞再度懸浮於蒸餾水中。
4. 用移植針沾一點細胞懸浮液抹在載玻片上，抹上1cm的薄片(1)。
5. 風乾後，細菌標本朝上，迅速通過酒精燈火焰數次，使細菌抹片。固定在載
玻片上。
6. 染色時先在抹片上滴一滴Crystal violet staining，1分鐘後以蒸餾水慢慢洗
去，並用吸水紙吸乾水分。
7. 在抹片上再滴一滴iodine mordant，1分鐘後以蒸餾水慢慢洗去，亦用吸水紙
吸乾水分。
8. 將載玻片浸泡於95% Ethanol中，並在其中慢慢晃動，30秒後拿出，用吸水紙
吸乾。
9. 滴一滴counter stain在抹片上，10秒後用蒸餾水慢慢洗至廢水無色，隨後用
水吸乾在光學顯微鏡下觀察。

	1.抹片要儘量做薄，才好觀察。
	2.LB培養液的配方是：	Bacto-tryptone		10g
				Bacto yeast extract	5g
				NaCl			10g
				add H2O to 1000ml
<預習報告>
1.把Gram-Staining的原理用圖形簡單描繪出來(最好把染劑粒子用色筆畫出 )。
這個圖形要表達整個染色過程。

微生物的觀察與培養(三)=Counting methods
<簡介>
十八世紀末，固態培養基的使用，使人們從此能夠用Colony counts的方法較
準確的計算樣品中各種微生物的數量。這個方法的理論基礎為，每一個單一的
微生物細胞在適當的固態培養基上都可以形成一個清晰易辨識的群落。
Colony count method和其他任何定性定量分析的方法一樣，實驗者操作時的
精確性及方法設計的準確度，都會影響所得結果的真實性。所以我們除了在操
作過程中要小心謹慎外，還要注意；(一)我們選擇的培養基適不適合，(二)培
養條件及培養時間的設定是否恰當，(三)我們的稀釋液及器皿中有沒有抑制微
生物生長的物質，(四)操作時是否能小心的不使微生物細胞受傷或不帶進其他
與微生物競爭生長的生物，(五)將微生物塗布在固態培養基上時能不能使之均
勻散布，使群落容易辨識。
除了colony count method外，如今利用coulter counter亦能準確而快速的計
算細胞數目，其計算原理如附錄所示。二者各有優劣點，前者操作步驟繁複、
耗時，但能精確的表示出培養液活菌的數目；後者操作簡便，但它是以粒子大
小作為計數根據，因此無論死菌活菌都會被算進去。所以研究者可依所需使用
不同的計數方法。
本實驗中，同學僅操作前者，後者由助教示範操作。其原因為由前者同學們除
了可以學得計數方法外，亦可粗略得知無菌操作及細菌培養的技術。

<材料及使用儀器>
1.生物材料：Escherichia coli
2.化學藥品：
	(a)培養細胞用：LB培養液(請看前面第一部分)
	(b)稀釋液：0.1% NaCl水溶液
	(c)塗布細胞用固態培養基：LB培養液+3%Agar
3.使用儀器：振盪器、無菌操作台、培養箱

<方法>
A.製備固態培養基
	將15∼20ml 已滅菌且溫度降至50℃左右之含3% Agar的LB培養基，
倒入無菌的培養皿(Petri dish)中。為使水氣蒸散，隨後我們將凝固了的培
養基倒置於25∼35℃的恆溫箱中18至24小時。

B.稀釋微生物
	1. E. coli 於37℃振盪培養七小時後，每毫升約含1×107至1×109
個細胞。而每個直徑9cm大小的 Agar plate上含 25∼250 個群落最適合計數，
所以將原液再以LB稀釋10倍及100倍，分別塗抹plates以供計數，每種plate做3
個重覆。

	2.稀釋時需注意事項如下：
	a.每一稀釋階段都要用振盪器振動15秒以上，以確保稀釋均勻，且試
	管靜置3mins以上就要重新振盪再使用。
	b.為防傷害細胞，稀釋時間要儘量縮短。
	c.將細菌稀釋液由試管移至plate上後，蓋好培養皿的蓋子，10秒後以
	塗抹棒均勻塗布。(從plate 2開始)

C.將塗布完成之plate移入37℃恆溫培養箱，倒蓋放置培養約12∼16小時，計數
colonies的數目。

<預習報告>
參閱附錄敘述Coulter principle。

<習題>
	1.畫出E. coli及Deinococuus sp.的形狀。
	2.依Colony count method所得結果，推算培養液中的活菌數。

Reference Page: