第一章 緒論
1-1 肝素(heparin)的結構與其臨床用途
肝素(heparin)是由部份磺化之右旋葡萄糖醛酸(D-glucuronic acid)及右旋胺基葡萄糖(D-glucosamine)組成的一種粘多醣類(mucopolysaccharide)，
其三級結構已被Mulloy 等人解出(Mulloy,1993; PDB ID:1HPN)。
肝素口服無治療效果，須靜脈或深層皮下注射才有效(Hirsh, 1992)，常用於心臟脈管手術(cardiopulmonary bypass)後用作抗凝劑，以防止血栓形成thrombosis(Bull et al., 1975)。在手術過後，為了預防血栓栓塞疾病(thromboembolic disease)時或血液透析等患者亦可使用。
硫酸魚精蛋白(protamine sulphate)，臨床上用來中和肝素的抗凝血作用，其本身胺基酸序列有65%以上由arginine組成，其胺基酸序列如下:
Protamine : PR4S3RPVR5PRVSR6G2R4
在體外實驗 (in vitro)也會與肝素有緊密的結合。當硫酸魚精蛋白在體內(in vivo)給藥，它會與血小板(platelets)，纖維蛋白原(fibrinogen)，及其他血漿蛋白(fibrinogen)產生交互作用(Gilman et al., 1990)，而且硫酸魚精蛋白在體外實驗也具有抗凝血的作用 (Perkash,1980)，它能延長活化部份成栓質時間(Activated Partial Thromboplastin Time aPTT)和前凝血時間。不過抗凝血作用較肝素(heparin)微弱。臨床上注射硫酸魚精蛋白發現，當硫酸魚精蛋白用來中和肝素給藥過量會產生抗凝血作用(Gilman et al.,1990)。
我們試著以結構生物學的眼光，設計出離胺酸以(i,i+3和i,i+4)的間隔與肝素產生作用，中和肝素的抗凝血作用，作為設計藥物的理念。
一般凝血路徑可分為兩種，一種為內因性路徑(intrinsic pathway)，另一種為外因性路徑(extrinsic pathway)(如圖一)，配合著PT,aPTT(見第二章)的測試，可得知何種凝血因子缺乏或被抑制。
凝血因子Xa(factor Xa)和凝血因子IXa(factor IXa)是血液中重要的絲安酸𠗟(serine protases)抑制劑，若缺乏抗凝血𠗟III (antithrombin III)會增加栓塞的形成。肝素會和抗凝血𠗟III結合產生抗凝血作用(Hirsh, et al., 1994 ; Jin,L. et al.,1997; Davie, E.W. et al.,1991)。
(From: Hirsh: Circulation, Volume 89(3).Mar 1994.pp 1449-1468.)
在1993，1994年(DeLuica ,A. et al.,1993;Wakefield,T.W. et al.,1994)以不同的Lys取代硫酸魚精蛋白上的Arg，這些帶不同的電荷的類魚精蛋白陽離子𠕇鋛(ploycationic protamione-like peptides)(如圖二陽離)這些synthetic protamine-like varient peptide隨著電荷的增加會增加逆轉肝素的抗凝血作用(reversal of heparin anticoagulation)和毒性(如圖三、圖四)，相反的電荷較少的毒性小但逆轉肝素的抗凝血作用的能力也比較小，這給我們一個啟示能不能設計一條以較少電荷的陽離子𠕇鋛且能夠與heparin結合?
肝素biding protein通常含有有很多鹼性胺基酸,Cardin等人(Cadin et al.,1989)提出兩種general type的
”consensus sequence”分別為X B B X B X
X B B X X B X
B為鹼性氨基酸，不過當時比較的sequence的蛋白質有限，之後發現更多能與肝素結合的胺基酸序列(Michel et al.,1992，Margalit,H. et al.,1992)，以下幾點設計我們如何設計出與肝素結合之陽離子𠕇鋛的構思。
從下列蛋白質的序列(sequences)，陽離子性胺基酸似乎有(I,I+3)(I,I+4)的間隔存在
表1-4-1
|
Protein |
Sequence |
|
Protein C inhibitor 1-15 |
HRHHPREMKKRRVEDL |
|
Protein C inhibitor 263-276 |
EKTLRKWLKMFKKR |
|
Antithrobin III 124-140 |
AKLNCRLYRKANKSSKL |
|
ColV 349-357 |
GKPGPRGQRGP |
94年Tyler-Cross,R.(Tyler-Cross,R. et.,1994)以等溫熱卡計(isothermal titration calorimetry)研究antithrombin III的heparin binding domain時發現在high affinity site有類似(i,i+3和i,i+4)的間隔(圖五、圖六、圖七)。
於是我們設計了一條與肝素結合的陽離子𠕇鋛
K34
: skaqkaqakqakqaqkaqkaqaKqakqy-Nh2設計理由如下
1.參考表1-4-1以(i,i+3和i,i+4)的離胺酸(lysine)間隔。
除了離胺酸間隔以外，離胺酸鄰近非帶電胺基酸也會影響𠕇鋛與肝素(heparin)結合後二級結構的變化(Stone,A.K. et al.,1977)，於是再參考過去胺基酸在𠕇鋛(peptides)在相關螺旋形成傾向 (helix-forming propensities) (Lyu,1990; O’Neill & DeGrado,1990)做其他位置的填補，以Alanine填補其他位置的原因，是因為Alanine經常出現在a 螺旋結構(a -helix)，且Alanine出現有穩定短鏈的a 螺旋𠕇鋛的作用(Lyu et al., 1990;Chakrabartty,A.,1994)，部份以glutamine取代是防止alanine和lysine形成amphipiphilic的結構，導致兩個K34形成dimer。
2.以NH2取代COOH是因為marcohelix dipole會增加helixity和
穩定 helix(Shoemaker,K.R. et al.,1987;Lockhart&Kim,1992,
1993)。
(Bryson: Science, Volume 270(5238).November 10, 1995.pp 935-941.)
3.在N端以絲安酸(Serine)開頭是為了產生capping box的作用使
螺旋殘基(helical residue)的第一個側鏈與第四個螺旋殘基的
骨鏈(backbone)形成氫鍵，相對的第四個殘基的側鏈和第一個殘
基的骨鏈形成氫鍵，進而穩定a 螺旋結構。(Lyu,1993 et
al.,1993;Petukhov,M. et al.,1996; Seale,J.W. et al.,1994)。
由以上的設計理念，我們可以設計K34在水溶液中應該是random coil 與肝素會會形成a 螺旋結構(a -helix)如下圖所示:
，而且所有的lysine會在同一面，如下圖
再藉由一連串K34和protamine與low molecular weight Heparin
的各種作用(如下圖)，能對蛋白質或𠕇鋛與肝素之間的作用力有更進一步的了解。
(From: Hirsh: Circulation, Volume 89(3).Mar 1994.pp 1449-1468.)
Molecular weight distributions of low molecular weight heparins and heparin. LMWH indicates low molecular weight hepari
The molecular weight of heparin ranges from 3000 to 30 000, with a mean of 15 000 (approximately 50 monosaccharide chains)
第二章 實驗材料與方法
2-1 𠕇鋛來源的製備
𠕇鋛由Millpore 9050 𠕇鋛合成儀(Peptide Synthesizer)所合成
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三氟醋酸(Trifluoroacetic ;TFA/Merck) |
|
|
酚(Phenol/Merck) |
|
|
tert-Butylmethylether/Merck |
|
|
Thioanisol/Aldrich |
|
|
Ethanedithiol/Merck |
|
|
去離子水 |
三.實驗方法
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試劑 |
體積 ( ml ) |
|
TFA |
8.3 |
|
Ethanodithiol |
0.25 |
|
Phenol |
0.45 |
|
Thioanisol |
0.5 |
|
去離子水 |
0.5 |
|
1. |
reagent K,其組成如上表 |
|
2. |
取含𠕇鋛的樹脂(約0.5g)倒入玻璃離心管，並加入 reagent K 6 ml。 |
|
3. |
每半小時利用細玻璃攪拌棒攪拌數次，持續4.5小時。 |
|
4. |
將玻璃過濾漏斗、磨口檢化瓶、塑膠管與Aspirator 組合並開水抽氣，將玻璃離心管內的reagent K和樹脂混和液倒入過濾漏斗中，而殘存在離心管內的樹脂用TFA再清洗，一併倒入過濾漏斗內。 |
|
5. |
過濾在磨口檢化瓶內的液體倒入另一含有Ether 的離心管內，可見管壁底部有白色沈澱(即裂從樹脂上切下的𠕇鋛)。 |
|
6. |
將含白色沈澱的離心管置入離心機內離心，完畢後倒去上清液，再加入 Ether 並充分攪拌後再置入離心機內離心，用以洗去溶質中的有機溶劑。 |
|
7. |
步驟6重複5次，最後一次倒去上清液後，置於通風槽內風乾Ether，隔夜後即可得裂解完成的𠕇鋛。 |
2-2 𠕇鋛的純化
一、試劑：
|
1. |
三氟醋酸 (Trifluoroacetic acid；TFA/Merck) |
|
2. |
Acetonitrile (ACN/TEDIA) |
|
3. |
去離子水 (已過濾) |
|
4. |
待純化的𠕇鋛 |
二、器材及儀器：
|
1. |
HPLC (Series 200 lc pump ; Perkin Elmer) |
|
2. |
HPLC 分離管柱 (Vydac. Protein/Peptide reverse phase column , 218 TP) |
|
3. |
UV dector (LC-295 UV/VIS dector；Perkin Elmer) |
|
4. |
HPLC 專用針筒 (Hamilton；0.5ml) |
|
5. |
真空乾燥器 |
三、實驗方法：
|
1. |
分別配製溶劑 A(H2O with 0.1%TFA)、溶劑 B(ACN:H2O = 6:4)和溶劑 D(ACN with 0.1%TFA) 並將其過濾、去氣泡 (degass)。 |
|
2. |
設定HPLC幫浦流速為 2ml/min，並設定UV dector偵測波長為220 nm。 |
|
3. |
將待純化的溶於去離子水 (< 10ml)並過濾。 |
|
4. |
用HPLC專用針筒吸取𠕇鋛溶液，注入 HPLC樣品入口後，調節溶劑A、B 的梯度。 |
|
5. |
收集光譜圖中的主波峰，累積所收集的溶液先用water pump 抽去有機溶劑，再放入液態氮中冷凍，待完全結冰後，放在真空乾燥機內抽乾溶劑，即可得粉狀、乾燥的𠕇鋛。 |
|
6. |
取少量純化後的𠕇鋛(< 1mg)作質譜儀分析，測其分子量與理論值是否符合。 |
四、備註：
K34 的分離條件:
|
STEP |
TIME |
FLOW |
%A |
%B |
%C |
%D |
CUR |
|
0 |
10 |
2.0 |
87 |
13 |
0 |
0 |
|
|
1 |
10 |
2.0 |
87 |
13 |
0 |
0 |
0 |
|
2 |
30 |
2.0 |
78 |
28 |
0 |
0 |
1 |
|
3 |
2 |
2.0 |
78 |
28 |
0 |
0 |
1 |
|
1. |
各𠕇鋛純化的溶劑梯度如上表： |
|
|
2. |
純化約 3-4個週期後，用溶劑D 沖洗HPLC管柱約20分，藉以將殘存於管柱內的雜質一併析出，達到清除的目的。 |
|
|
3. |
𠕇鋛的序列為： |
|
|
K34 |
SKAQKAQAKQAKQAQKAQKAQAKQAKQY-NH2 |
2-3 𠕇鋛濃度的定量
一、試劑：
|
1. |
Guanidine Hydrochloride (GuHCl/ Merck) |
|
2. |
去離子水 (已過濾) |
|
3. |
實驗樣品 |
二、器材及儀器：
|
1. |
石英管 (cuvette) |
|
2. |
UV dector |
|
3. |
Pipette |
|
4. |
Tip |
|
5. |
Eppendorff |
|
6. |
電子天平 |
|
7. |
震盪器 |
三、實驗方法：
|
1. |
用電子天平秤取純化後的樣品並記錄後，放入eppendorff中。 |
|
2. |
事前依𠕇鋛分子量約略估算樣品的重量值達特定濃度所需溶劑的體積，並加入該體積的去離子水到eppendorff中，利用震盪器使樣品充分溶解。 |
|
3. |
配製6M 的GuHCl，取280 ul裝入石英管中以作為 blank。 |
|
4. |
啟動 UV dector，設定吸收波長為275.5nm並歸零。 |
|
5. |
加入10 ul的樣品溶液，觀察在該波長的吸收值。 |
|
6. |
再加入10 ul的樣品溶液，觀察在該波長的吸收值。 |
|
7. |
重複步驟 3-6 二到三次，觀察漸次加入樣品(0 ,10, 20 ul) 的平均吸收值有無線性關係。 |
|
8. |
依照 Beer's Law 公式，帶入 e = 1475 cm-1M-1 (Harold Edelhoch,1967)可得實驗測得濃度值。 |
2-4 旋光儀實驗
一、試劑：
|
1. |
三氟乙醇 (Trifluoroethanol ; TFE/Riedel-deHaen) |
|
2. |
去離子水 (已過濾) |
|
3. |
實驗樣品 (K34) |
|
4. |
氯化鈉(NaCl; Frisher Scientific) |
|
5. |
硫酸魚精蛋白(protamine sulfate ; Grade X from Salmon ,Sigma) |
|
7. |
低分子量肝素(low molecular weight: sodium salt ;from porcine intestinal ,Sigma) |
二、器材及儀器：
|
1. |
旋光儀 (Aviv model 62A spectropolarimeter) |
|
2. |
管徑(path length)為 0.1 cm的石英管 |
|
3. |
平頭注射針筒 (Hamilton) |
|
4. |
氮氣筒 |
|
5. |
玻璃樣本瓶 |
三、K34加入TFE 實驗方法：
|
1. |
啟動旋光儀，設定波長範圍為190 - 260nm、溫度25℃、掃瞄三次。 |
|
2. |
將石英管(0.1 cm)內裝定量體積的 blank (290ul H2O)溶液，放入CD樣品槽內測其旋光值q b。 |
|
3. |
取出石英管，加入 10 ul的𠕇鋛溶液，充分混合後放入CD樣品槽內測其旋光值q s。 |
|
4. |
利用平頭注射針筒取出石英管內的混合液，置入玻璃樣本瓶中，清洗石英管並用氮氣吹乾。 |
|
5. |
配合不同TFE% 的條件(見備註1.2)，重複上述步驟，完成TFE 的漸次滴定 (serial titration) 實驗。 |
四、K34加入Heparin 實驗方法：
|
1. |
啟動旋光儀，設定波長範圍為190 - 260nm、溫度25℃、掃瞄三次。 |
|
2. |
將石英管內裝定量體積的 blank (290ul H2O)溶液，放入CD樣品槽內測其旋光值 q b。 |
|
3. |
取出石英管，加入 10 ul 的𠕇鋛溶液，充分混合後放入CD樣品槽內測其旋光值q s。 |
|
4. |
利用平頭注射針筒取出石英管內的混合液，置入玻璃樣本瓶中，清洗石英管並用氮氣吹乾。 |
|
5. |
配合不同Heparin% 的條件(見備註3.)，重複上述步驟，完成heparin 的漸次滴定 (serial titration) 實驗。 |
五、硫酸魚精蛋白(protamine sulphate)加入Heparin 實驗方法：
|
1. |
啟動旋光儀，設定波長範圍為195 - 260nm、溫度25℃、掃瞄三次。 |
|
2. |
將石英管內裝定量體積的 blank 溶液，放入CD樣品槽內測其旋光值 q b。 |
|
3. |
取出石英管，加入 20 ul 的𠕇鋛溶液(硫酸魚精蛋白stock solution為0.45mM)，充分混合後放入CD樣品槽內測其旋光值q s。 |
|
4. |
利用平頭注射針筒取出石英管內的混合液，置入玻璃樣本瓶中，清洗石英管並用氮氣吹乾。 |
|
5. |
配合不同Heparin% 的條件(見備註4.)，重複上述步驟，完成heparin 的漸次滴定 (serial titration) 實驗。 |
六、K34加入NaCl 實驗方法：
|
1. |
啟動旋光儀，設定波長範圍為200 - 260nm、溫度25℃、掃瞄三次。 |
|
2. |
將石英管內裝定量體積的 blank 溶液，放入CD樣品槽內測其旋光值 q b。 |
|
3. |
取出石英管，加入 10 ul 的𠕇鋛溶液，75ul heparin，充分混合後放入CD樣品槽內測其旋光值q s。 |
|
4. |
利用平頭注射針筒取出石英管內的混合液，置入玻璃樣本瓶中，清洗石英管並用氮氣吹乾。 |
|
5. |
以NaCl(5M)做各種不同的滴定，其滴定條件(見備註5.)，重複上述步驟，完成NaCl 的漸次滴定 (serial titration) 實驗。 |
七、K34加入Heparin變溫實驗方法：
|
1. |
啟動旋光儀，alt+T進入變溫模式(Temperature mode)設定波長範圍為222nm、溫度25℃->80℃溫度間隔為1℃，平衡溫度時間為0.5min。 |
|
2. |
重複上述步驟溫度由80℃->25℃。 |
|
3. |
重複上述步驟溫度由4℃->90℃。 |
|
4. |
重複上述步驟溫度由90℃->4℃。 |
八、protamine sulfate 滴定飽和K34實驗方法：
|
1. |
啟動旋光儀，設定波長範圍為200 - 260nm、溫度25℃、掃瞄三次。 |
|
2. |
將K34加入飽和量heparin。 |
|
3. |
再配合不同Protamine sulfate滴定K34-heparin的飽和溶液，條件，重複上述步驟。 |
九、K34滴定飽和protamine sulfate 實驗方法：
|
1. |
啟動旋光儀，設定波長範圍為205 - 260nm、溫度25℃、掃瞄三次。 |
|
2. |
將protamine sulfate加入少於飽和量heparin。 |
|
3. |
再配合不同K34滴定的 Protamine sulfate-heparin溶液，條件，重複上述步驟。 |
十.備註
1.
|
次數 |
加入TFE的量(ml) |
累積體積(ml) |
TFE % |
|
0 |
0 |
150 |
0 |
|
1 |
16.67 |
166.67 |
10 |
|
2 |
20.83 |
187.5 |
20 |
|
3 |
26.79 |
214.28 |
30 |
|
4 |
35.7 |
249.98 |
40 |
|
5 |
50 |
299.98 |
50 |
2.
|
次數 |
加入H2O的量(ml) |
累積體積(ml) |
TFE % |
|
0 |
0 |
150 |
100 |
|
1 |
16.67 |
166.67 |
90 |
|
2 |
20.83 |
187.5 |
80 |
|
3 |
26.79 |
214.28 |
70 |
|
4 |
35.7 |
249.98 |
60 |
3.
|
加入Heparin的量(ul) |
加入Heparin的濃度(mM) |
|
2 |
0.0066 |
|
4 |
0.0132 |
|
10 |
0.0322 |
|
20 |
0.0635 |
|
35 |
0.0104 |
|
55 |
0.155 |
|
75 |
0.200 |
|
95 |
0.241 |
4.
|
加入Heparin的量(ul) |
加入Heparin的濃度(mM) |
|
10 |
0.032 |
|
20 |
0.063 |
|
35 |
0.104 |
|
55 |
0.155 |
5.
|
加入NaCl的量(ul) |
加入NaCl的濃度(M) |
|
2 |
0.026 |
|
4 |
0.053 |
|
6 |
0.078 |
|
10 |
0.130 |
|
15 |
0.188 |
|
25 |
0.294 |
|
45 |
0.506 |
|
65 |
0.699 |
2-5 抗凝血測試原理簡介
一.凝血𠗟原(prothromin Time，PT)
凝血𠗟原(Prothrombin)為血漿中重要的凝固因子之一，將過量的組織凝血活化𠗟(Tissue thromboplastin)及適量的鈣離子加檸檬酸鈉為抗凝劑的鮮血時，會立刻引起外在路徑及共同路徑的活化，而產生纖維蛋白凝固。此一連串的反應中所需的時間，既為凝血𠗟原時間(PT)( Loeliger, E.A. ,1985;Dombrose, F.A.,1982)。
Tissue thromboplastin
Ca2+
二.活化部份凝血𠗟時間(Activated Partial
Thromboplastin Time，aPTT)
活化部份凝血𠗟時間(aPTT)廣用於偵測內在凝血路徑因子異常。其方法係以過量的活化部份凝血𠗟及檸檬酸鹽血漿混合，加適量的鈣離子，立刻引起內在路徑的活化，最後產生纖維蛋白(fibrin)。在此一連串的反應中所需的時間，即為aPTT(何敏夫，1993; Dombrose FA,1982;Charles WF,1985)。
Prithrombin
aPTT XII VII PTHMWK Prek
XI
IX
VIII
X X
V V
Thrombin
2-6 抗凝血實驗
一、試劑：
|
1. |
PT(Tissue thromboplastin with calcium ions)(Organon Teknika) |
|
2. |
APTT(Activator reagents) (Organon Teknika) |
|
3. |
Verify 1 (Organon Teknika) |
|
4. |
硫酸魚精蛋白注射劑(protamine sulphate;5ml LEO) |
5.Thromboplastin reagent (Organon Teknika)
6.Phosphlipid reagent with activator (Organon Teknika)
二、器材及儀器：
儀器:凝固測定器(Coagulometer,COAG-A-MATE XM;Organon)
PT實驗
|
1. |
加0.5ml血漿(Plasma),若有加肝素或𠕇鋛，則在此時加入。 |
|
2. |
檢體開始預溫(37.5℃)180秒 |
|
3. |
[嗶]響預溫結束，關閉音效，蓋好測試槽蓋 |
|
4. |
加入PT試劑 |
PT簡易操作步驟
加入0.5ml Plasma
u
|
WARM |
u
|
START |
u
|
加入0.1ml Thromboplastin reagent |
u
|
螢幕顯示結果 |
APTT實驗
|
1. |
加0.5ml血漿(Plasma) ，若有加肝素或𠕇鋛，則在此時加入。 |
|
2. |
檢體開始預溫(37.5℃)60秒，加入APTT試劑 |
|
3. |
[嗶]響預溫結束，關閉音效 |
|
4. |
檢體與試劑開始活化300秒，[嗶]響預溫結束，關閉音效，蓋好測試槽蓋 |
|
5. |
加入CaCl2試劑 |
加入0.5ml Plasma
u
|
APTT |
u
|
WARM |
u
|
加0.5ml Activitor(Phosphlipid reagent with activator) |
u
|
加0.5ml Activitor (CaCl2) |
u
|
START |
u
|
螢幕顯示結果 |
2-7 K34和protamine競爭heparin實驗
一、試劑：
|
1. |
三氟醋酸 (Trifluoroacetic acid；TFA/Merck) |
|
2. |
Acetonitrile (ACN/Lab-Scan) |
|
3. |
去離子水 (已過濾) |
|
4. |
實驗樣品 |
二、器材及儀器：
|
1. |
HPLC (Programmable Detector Module 126 ; Beckman) |
|
2. |
HPLC 分離管柱 (reverse phase column, Lichrosphere 100-RP8.5 um,4´ 250mm;Merck) |
|
3. |
UV dector ((Programmable Detector Module 166 ; Beckman)) |
三、實驗方法：
|
1. |
分別配製溶劑 A(H2O with 0.1%TFA)、溶劑 B(ACN:H2O = 6:4)分別加入0.1%TFA 並將其過濾。 |
|
2. |
設定HPLC幫浦流速為 1ml/min，並設定UV dector偵測波長為230 nm。 |
|
3. |
取HiTrap Heparin 1ul gel(Pharmacia Biotech)將不同量的protamine(0.1,1,3,10,30,100 ul)加入等量的K34(54 ul)震盪4小時,總體積為100 ul。 |
|
4. |
分別取上清液打HPLC，對其吸收峰做積分 |
2-8 結構模擬
一.Docking
程式:insightII->Biopolymer->建立一個helix的K34
->Modify->hydrogen->PH=7.0
->Forcefild->Potential
->partial _Chg action a Fix
->Formal Chg action a Fix
Docking:進入PDB下載的Heparin(PDB ID:1HPN)與上述所做之K31做docking
docking好之後merge成一個檔案
二.K34與heparin的最小能量化(mininzation):
程式:insightII->Discover->載入上述檔案
parameters->mininize
三. K34與heparin的動力模擬:
程式:insightII->Discover_3
設定:
2.specify->Nonbonds:Activations:add
Summation method->Group_Based
Cutoff Distance->16 AO
Spline Width->1.0 AO
Buffer width->0.5 AO
3.calculate->dynamics:Run Time fs->5000.0
Temperature K->298.0
4.analyze->output:Averaging method a Running
a Batch
Energy_Output a Total_E
a Kinetic_E
a Potential_E
a Coulomb_E
a VdW_Total_E
a Temputerature_Output
四.建立K34與heparin的Surface
程式:insightII->Docking
設定:
1.Grid:輸入動力模擬之後的檔案
->compute-> cut_off->5
|
能量形式 |
平均能量 |
RMSD |
|
Tot. N.B. |
493.68775 |
11.53277 |
|
Coul. E. |
340.19991 |
4.46856 |
|
VdW. E. |
153.48786 |
10.98556 |
|
能量形式 |
平均能量 |
RMSD |
|
Tot. E. |
1790.96859 |
15.29759 |
|
Pot. E. |
564.90501 |
5.65107 |
|
Kin. E. |
1226.06355 |
15.01258 |
備註:1.除了建立Surface在O2執行，其餘皆在indy執行
2.圖八、圖九為動力模擬觀測的能量變化
3.RMSD及平均能量的計算皆取6000-10000(Time fs)
Tot. E.= Total Energy
Kin. E.= Kinetic Energy
Pot. E.= Potential Energy
Tot. N. B.= Total non-bound Energy
Coul. E. =Coulomb Energy
vdW. E. =van der Walls Energy
第三章 結果與討論
3-1 𠕇鋛純化的鑑定
圖十一、為 HPLC 純化各𠕇鋛在溶劑 A、B 梯度變換中𠕇鋛所析出的結果，從圖中吾人推定主訊號(major peak)即為𠕇鋛合成儀所合成的主產物 (major product)。在純化收集後，經過MALDI質譜儀(Fitezgerald ,M.C. et al.,1996)鑑定𠕇鋛質量為3086.5(如圖十二) ，確認該合成𠕇鋛完全符合預估的3086.58。
3-2 肝素與K34及魚精蛋白的二級結構
K34含有許多帶正電的離胺酸，推測離胺酸本身之間的正電排斥作用導致在水溶液的環境下沒有明顯的二級結構，隨著肝素的加入後會增加K34由無序結構(random coil)變成-a 螺旋結構(a -helix)(圖十三)，隨著肝素濃度的增加，作為螺旋指標的222nm也隨之增加(圖十四)，相對於硫酸魚精蛋白(protamine sulphate)，在早期Toniolo (Toniolo,C.,1980)曾以Chou and Fasman的方法預測protamine會有a 螺旋結構(a -helix)，然而硫酸魚精單獨在水溶液中為無序結構(random coil)，隨著加入肝素之後還是保持原本的無序結構(random coil) (圖十五)，所以肝素可能藉由鹽橋(salt bridge)增加𠕇鋛中含有螺旋形式(helical conformation) (Sobel et al.,1992)。
3-3 肝素與K34之間的鹽橋作用
為了探討鹽橋在K34與肝素之間鹽橋的作用，我們以不同濃度的NaCl做滴定(Lyu et.al.,1992)，a 螺旋結構(a -helix)
隨著NaCl濃度的增加而降低(圖十六)(圖十七)，顯然NaCl破壞heparin和K34的鹽橋作用而降低a 螺旋結構(a -helix)，因此肝素誘導K34產生a 螺旋結構(a -helix)中，鹽橋是穩定其結構的重要因素之一。
加入肝素到K34達到飽和，再以不同溫度對[q ]222作圖(Gans, P.J.,1991)(圖十八A)，發現隨著溫度由25℃上升到80℃，a 螺旋結構(a -helix)隨之降低，但溫度由80℃下降到25℃，K34的a 螺旋結構(a -helix)似乎又回到了原本在25℃的吸收值，(圖十八B)溫度變化由4℃上升到90℃再由90℃下降到4℃，比較(圖十八A) (圖十八B)發現溫度上升到90℃之後並沒有辦法像(圖十八A)恢復到起始溫度的吸收，所以溫度在80~90℃可能會造成K34或heparin結構上的破壞。
3-4 TFE與K34之間的作用
K34分子內因為lysine的正電排斥，導致在水溶液中呈現無序結構(random coil)，利用不同%TFE觀察K34是否在TFE的影響下變成a 螺旋結構(a -helix)(Searle,1995)。結果隨著TFE的增加K34的a 螺旋結構(a -helix)也隨之而增加，所以除了heparin以外K34還可以被TFE誘導(induce)成a 螺旋結構(a -helix)，就TFE而言，具有非特異性(Non-specific) 螺旋誘導(helix-induction) 的作用(Arunkumar,1997)。
3-5 凝血實驗
一. PT實驗:
|
PT (sec) |
PT (sec) |
平均PT (sec) |
標準偏差 (sec) |
|
|
血漿凝血時間 |
12 |
12.7 |
12.35 |
0.49497 |
表3-5-1
|
加入肝素的量 (nmole heparin) |
PT (sec) |
PT (sec) |
PT (sec) |
平均PT (sec) |
標準偏差 (sec) |
|
5 |
15.2 |
14.9 |
15.6 |
15.23 |
0.35119 |
|
10 |
15.7 |
15.6 |
17.6 |
16.27 |
1.12694 |
|
20 |
21.3 |
19.7 |
20.3 |
20.43 |
0.80829 |
|
50 |
32.7 |
35.1 |
38.3 |
35.37 |
2.80951 |
表3-5-2
|
加入肝素的量 50nmole heparin再加入K34的量 ( nmole ) |
PT (sec) |
PT (sec) |
PT (sec) |
平均PT (sec) |
標準偏差 (sec) |
|
24.34 |
17.1 |
15.9 |
17.6 |
16.87 |
0.87369 |
|
42.60 |
14.9 |
15.1 |
15.9 |
15.3 |
0.52915 |
|
60.85 |
14.3 |
13.8 |
14.05 |
14.05 |
0.25 |
表3-5-3
|
加入肝素的量 50nmole heparin 再加入 Protamine Sulphate 的量 (nmole) |
PT (sec) |
PT (sec) |
PT (sec) |
平均PT (sec) |
標準偏差 (sec) |
|
0.03 |
21.2 |
24.4 |
22.8 |
2.26274 |
|
|
1.95 |
17.5 |
18 |
19.7 |
18.4 |
1.15326 |
|
3.9 |
13.8 |
14.3 |
14.9 |
14.33 |
0.55076 |
表3-5-4
|
K34單獨存在的量 (nmole) |
PT (sec) |
PT (sec) |
平均PT (sec) |
|
60.85 |
12.0 |
11.9 |
11.95 |
表3-5-5
|
Protamine sulphate單獨存在的量 (nmole) |
PT (sec) |
PT (sec) |
平均PT (sec) |
標準偏差 (sec) |
|
0.03 |
43.5 |
47 |
45.25 |
1.861 |
|
1.95 |
>>> |
>>> |
>>> |
|
|
3.9 |
>>> |
>>> |
>>> |
註:1.>>>表示時間超過50(sec)無法測定
二 aPTT實驗
|
aPTT (sec) |
aPTT (sec) |
APTT (sec) |
aPTT (sec) |
標準偏差 (sec) |
|
|
血漿凝血時間 |
25 |
27.1 |
28.6 |
26.9 |
1.80831 |
表3-5-6
|
加入肝素的量 (nmole heparin) |
aPTT (sec) |
aPTT (sec) |
aPTT (sec) |
平均aPTT (sec) |
標準偏差 (sec) |
|
0.1 |
35.3 |
33.2 |
37.1 |
35.2 |
1.95192 |
|
0.2 |
41.3 |
42.8 |
40.1 |
41.4 |
1.35277 |
|
0.5 |
64.4 |
70.4 |
70.3 |
68.27 |
3.4356 |
表3-5-7
|
加入肝素的量0.5nmole heparin再加Protamine Sulphate的量 (nmole) |
aPTT (sec) |
aPTT (sec) |
aPTT (sec) |
平均aPTT (sec) |
標準偏差 (sec) |
|
0.195 |
29.4 |
31.6 |
29.9 |
30.3 |
1.15326 |
表3-5-8
|
加入肝素的量0.5 nmole heparin再加入K34的量 (nmole ) |
aPTT (sec) |
|
0.121 |
64.5 |
|
0.605 |
62 |
|
1.21 |
67.2 |
|
2.42 |
70.7 |
|
6.05 |
65.7 |
|
12.1 |
72 |
註:1.>>>表示時間超過50(sec)無法測定
從上列凝血實驗中發現，無論是PT(表3-5-1)或是APTT表(3-5-6)凝血時間都因肝素的加入會變長，在逐漸加入Protamine Sulphate(表3-5-3)之後PT凝血時間縮短，但Protamine Sulphate如果單獨存在下會引發比Heparin更長的凝血時間(表3-5-5)，也就是說如果使用Protamine Sulphate過量會造成與heparin相同的抗凝血作用(Gilman et al, 1990)，反觀K34不但有中和heparin的抗凝血作用(表3-5-2)，且單獨存在時並不會有抗凝血的情況發生(表3-5-4)，不過在APTT抗凝血實驗當中，我們並沒有發現有縮短heparin的抗凝血時間的情況發生(表3-5-8)，然而Protamine Sulphate中和肝素的抗凝血能力還是存在(表3-5-7)。
3-6 K34和protamine sulfate與heparin的競爭作用
(圖二十四)以Protamine sulfates滴定heparin飽和的K34，作為螺旋指標的222nm並沒有隨Protamine sulfates濃度的增加而降低，不過隨著Protamine sulfates逐漸增加，便會產生aggregation，於是改用少量的heparin加Protamine sulfates，以K34滴定，發現作為螺旋指標的222nm並沒有K34濃度的增加增加(圖二十五)。
於是我們再做另外一個實驗，以固定量的HiTrap heparin gel加入固定量的K34(54uM)，在加入不同濃度的Protamine sulfates
(0.1,1,3,10,30,100uM)，發現隨著Protamine sulfates濃度的增加，K34原本與HiTrap heparin結合的量逐漸被Protamine sulfates所取代。
3-7 討論
本實驗的初步結果可得知，K34比硫酸魚精蛋白較不具有抗凝的作用，至於是否會有類似硫酸魚精蛋白的其他副作用，例如低血壓(hypotension)、降低血小板及白血球的數目(declines in platelet and white blood cell counts)、降低氧的利用(diminished oxygen utilization) 和心跳徐緩(bradycardia) 、 降低心肌功能(myocardial function)等反應(Horrow J.C., 1985 ; Montalescot G.et al.,1990; DeLuica A.et al.,1993 , Lowenstein,E. et al.,1983)，則須進一步的做動物活體實驗，關於帶正電的化合物為何會引起血管擴張的作用原因，到目前為止還不是很清楚，其中一個假說(hypothesis)是在迅速反轉antithrombin III造成thrombin暴露其結果造成血管的擴張(vasodilatory)及血壓的下降(hypotension)(D’Orleans,J.P. et al.,1985)另外一種假說是protamine或者類似魚精蛋白的化合物(protamine-like positively compound)會與血管壁的產生類似nitric oxide的內皮細胞衍生釋放因子(endothelium-derived relaxing factor)(Akata, T. et al.,1991)作用，最近有報導指出(Ignarro,L.J. et al.,1989)含有L-arginine，L-lysine，或L-ornithine的𠕇鋛會引發內皮細胞依賴型動脈血管擴張(endothelium-dependent relaxation of arteries)和cyclic guanosine monophosphate(cGNP)調控的血管擴張，以上這些作用在手術當中發生是相當危險的，我們所設計的K34將離胺酸(lysine)朝向同一面，希望與肝素產生結合之後，另外一面沒有帶正電的胺基酸造成上述的副作用，關於這方面還需要進一步的做相關的藥理實驗來證明。
以lysine取代protamine上的arginine(DeLuica,A.et al.,1993)並沒有像改變電荷數目有如此重大差異，但arginine取代K34的lysine會不會有更好的效果，值得進一步的探討。
到目前為止做過與肝素有結合的蛋白質或𠕇鋛並不夠多,我們並沒有辦法斷定具有什麼樣的胺基酸序列才能和肝素產生結合，或結合之後會產生什麼樣的二極結構，不過就本實驗而言可以發現具有(i,i+3和i,i+4)間隔的陽離子𠕇鋛具有和肝素結合的能力。
從抗凝血實驗中發現與K34和protamine在HiTrap heparin的競爭上可發現K34不如protamine來的強，導致在外在凝血路徑有作用，內在路徑卻看不到有逆轉heparin的抗凝血作用，可能因為heparin與內在凝血因子XII,XI,IX,IIX等有較強於K34的引力，而protamine則因為含有較多電荷，所以有較強的作用。
K34當初以較少的電荷設計是為以較少的電荷和肝素產生結合，避免Protamine sulfates的副作用，然而從上面的實驗發現，Protamine sulfates(33個胺基酸,21個帶正電胺基酸)與肝素的作用比較強源自於太多正電荷，因此增加K34(28個胺基酸,8個帶正電胺基酸)可以增加與肝素的結合能力。
3-8 結論
綜觀上述的實驗，可的到下列結果
helix)，而且離胺酸以(i,i+3和i,i+4)的間隔可以是肝素的結合
序列(binding sequences)。
離子𠕇鋛的二級結構有重要的影響。
Protamine sulphate 和K34的比較
|
Protamine sulphate |
K34 |
|
|
胺基酸序列 |
PR4S3RPVR5PRVSR6G2R4 |
skaqkaqakqakqaqkaqkaqaKqakqy-Nh2 |
|
與肝素結合後的二極結構 |
無序結構 (圖二十四) |
a 螺旋結構 (圖十三) |
|
與肝素結合力大小比較 |
較大(圖二十六) |
較小(圖二十六) |
|
是否會逆轉肝素在內因性凝血路徑(intrinsic pathway)的作用(aPPT實驗)? |
是 (表3-5-7) |
否 (表3-5-8) |
|
是否會逆轉肝素在外因性凝血路徑(extrinsic pathway) 的作用(PT實驗)? |
是 (表3-5-3) |
是 (表3-5-2) |
|
以治療劑量在沒有肝素存在之下，是否會有抗凝血的作用? |
是 (表3-5-5) |
否 (表3-5-4) |
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逆轉肝素的抗凝血劑量大小 |
所需劑量較小 |
所需劑量較大 |