實驗目的

學習培養昆蟲細胞及細胞密度的計算。

緒論

由於桿狀病毒載體的建立，使得昆蟲細胞的培養蓬勃發展，利用批次放大培養昆蟲細胞，以大規模生產重組蛋白質。昆蟲細胞的種類大致分成三種：纖維母細胞(fibroblast cell)，類上皮細胞(epitheloid cell)，和血球細胞(hemocyte)。目前研究最多的是SF細胞株，能懸浮培養或貼盤培養於25-28℃，細胞倍增時間為18-24小時。

實驗材料

SF-9 昆蟲細胞

TNM-FH 添加10% FBS

T-flask

Trypan blue

步驟

將SF-9昆蟲細胞以TNM-FH添加10% FBS培養於T-flask，以28℃培養3-4天至細胞長滿，以顯微鏡觀察細胞形態，之後利用吸量管沖散細胞，留下1/5並加入新鮮的培養基作繼代培養。
取0.5ml的細胞液加入0.5ml 4%的trypan blue進行染色，滴入血球計數器中，在顯微鏡下計數。

(活細胞/死細胞)
 

20/16		138/50
	56/33

血球計數器中細胞總數：313

細胞密度：(313/3)x10=1043.3      1043.3x10³x2(稀釋倍數)=2.09x10⁶

存活率：(214/313)x100%=68%

討論

1. 以血球計數器計數時，由於助教將蓋玻片只蓋到九格的前兩排，使得下面有兩格的數據無法計算，而加染料的五分鐘之內最好可以算完細胞，因此沒有重算一次，只用三格的數據去計算細胞密度，應會產生統計上的誤差。
2. 和其他同學比較細胞密度的數值，可以發現差異滿大的因為只有用吸量管沖散細胞，長在flask邊緣的細胞，就沖不下來了，而且細胞貼盤有點緊密，導致很難沖刷下來，必須要用吸量管的尖端慢慢刮下細胞，到了的邊緣部分更不可能刮到了，因此可能須要有特製的刮細胞的器具輔助，或者是使用typsin-EDTA幫助打散細胞，血清中含有胰蛋白脢的抑制物，以新鮮的培養基加入後就可以抑制其作用(作用溫度為37℃)
3. 細胞的viability並不高猜想跟我們用暴力的刮法有關。
4. 影響細胞培養長得好不好或形態正常與否有幾個關鍵：
1. 培養細胞的環境
2. 使用的培養基及培養基有無被污染
3. 養份夠不夠
4. 培養細胞的技術
5. 在做細胞培養的時候要有良好的紀錄習慣在發生問題時才容易了解從而處下手改進要紀錄的主要有: 培養的細胞株，接種的密度，所用的培養基及藥品，甚至是培養基及藥品的批號，培養及用藥的時間，用藥時細胞的滿度，以及細胞的代數(一般是算分盤一次為一代)。
6. 所使的培養基平常應有妥善的保存，一般來說應置放於2~8℃中黑暗保存，(不過並不清楚我們用的昆蟲細胞的培養基的保存方式)，不正確的溫度或曝光，都會引起培養基組成物質的分解，並可能會形成有毒物質，所以在使用之前的回溫步驟也不能太久，當發現培養基過期或呈混濁有沉澱時，就應不要使用。以粉末配製液體培養基時，易因溶解不完全，pH值偏差，或水溫過高(先滅過菌)而有錯誤。一般以孔徑0.2 mm材質為cellulose acetate的濾膜將之過濾滅菌(血清需於過濾後再加入，以免一些大分子的必須成份被過濾掉了)。
7. 溫度:哺乳類動物細胞需養在37±2℃，而昆蟲細胞則需培養在25±2℃的環境中
8. pH值:絕大部份的細胞對其環境pH值相當敏感，過酸或過鹼都會使細胞生長不良或對細胞造成永久性傷害。大部份哺乳類動物細胞最適生長的pH值為7.4左右，而昆蟲細胞則為6.2。環境的pH值會隨著營養成份減少，及呼吸作用產物的增加而改變。
9. 二氧化碳:哺乳類動物細胞培養基中含有緩衝物質，需要有二氧化碳的存在才能發揮緩衝作用。若是二氧化碳的量不足則易造成劇烈的pH值變化。在培養的過程中需將容器的蓋子稍為旋開以增加氣體交換速率。昆蟲細胞培養基含有緩衝物質，並不依賴有二氧化碳才能發揮作用，所以這類培養基在使用時，僅需放在正常的大氣環境中即可。
10. 濕度:濕度太低會使培養基水份蒸發太多，鹽濃度提高而細胞發生崩解。故在培養箱底部擺上一盆水可提供足夠的水份來維持濕度。
11. 微生物污染的種類有細菌，黴漿菌(mycoplasma)，病毒(virus)，真菌(fungi)的污染。污染時，會發現有培養基呈混濁，細胞生長遲緩，細胞不附著，細胞形態發生變化，甚至有細胞崩解的現象。培養細胞時，可加入streptomycin及penicillin等抗生素來抑制微生物生長。
12. 接種細胞的數量不正確會導致細胞過量生長或細胞量過少，而接種細胞的數量應依細胞種類，使用的培養基，dish的大小,細胞株的使用期限來決定。但是若實驗不需定量細胞的數目就不必管接種的密度，只要細胞能長到可以用來進行實驗的細胞量即可。因此這個實驗我們雖然有用血球計數器，但並沒有定量接種的細胞數。